texto completo INHIBICIÓN DE CÉLULAS CANCERÍGENAS

Evid Based Complemento Alternat Med. 2013, 2013: 219472.
. Publicado en línea 07 de abril 2013 doi:  10.1155/2013/219472
PMCID: PMC3638576

Ganoderma tsugae extracto inhibe el crecimiento de células que sobreexpresan HER2 del cáncer a través de la modulación de la vía de señalización HER2/PI3K/Akt

Han Peng-Kuo , 1 Shih-Chung Hsu , 2 Chien Chih-Ou , 3 Jhy-Wei Li , 4 Hsiu-Hsueh Tseng , 5 Chuang Tzu-Chao , 6Jah-Yao Liu , 7 Shih-Jung Chen , 8 Muh- Su Hwan , 9 Yung-Chi Cheng , 10 -Yuan Wei Chou , 11 y Ming Ching Kao-1, 11, *
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Abstracto

Ganoderma , también conocido como Lingzhi o Reishi se ha utilizado con fines medicinales en los países asiáticos durante siglos. Es un hongo medicinal con una variedad de propiedades biológicas incluyendo actividades inmunomoduladoras y antitumorales. En este estudio, hemos investigado los mecanismos moleculares por los cuales Ganoderma tsugae (GT), una de las especies más comunes de Ganoderma , inhibe la proliferación de las células cancerosas sobreexpresan HER2.Aquí, se muestra que un extracto de calidad garantizada de GT (GTE) inhibió el crecimiento de las células cancerosas sobreexpresan HER2 in vitro y in vivo y mejor será el efecto inhibidor del crecimiento de los fármacos antitumorales (por ejemplo, taxol y cisplatino) en estas células.También demuestran que GTE inducida por la detención del ciclo celular al interferir con la vía de señalización HER2/PI3K/Akt. Además, GTE redujo la expresión de la proteína HER2 mediante la modulación de la actividad transcripcional de la HER2 gen y la estabilidad / degradación de la proteína HER2. En conclusión, este estudio sugiere que GTE puede ser un agente terapéutico adyuvante útil en el tratamiento de las células cancerosas que expresan altamente HER2.

1. Introducción

De crecimiento epidérmico humano receptor del factor de 2 (HER2) es un 185-kDa transmembrana del receptor de tirosina quinasa (RTK), que pertenece al receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la familia, que contiene cuatro miembros homólogos: EGFR/HER1, HER2, HER3, y HER4 . Estimulación ligando induce la dimerización del receptor HER (homo-o heterodímero), que conduce a la auto-fosforilación (a excepción de HER3) en residuos de tirosina localizados en el dominio C-terminal de los receptores HER. Entonces, los receptores HER fosforilados (forma activada) activan una variedad de vías de señalización corriente abajo, tales como los de la proteína quinasa vías de Ras / activadas por mitógenos (MAPK) fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) / Akt y, que a su vez promueven la célula proliferación, supervivencia, y la metástasis [ 1 ].

Regulación positiva aberrante de HER2 se encuentra en aproximadamente el 25-30% de los cánceres de mama [ 2 ] y en 6-50% de los cánceres de ovario [ 3 ]. Los pacientes con cáncer HER2-positivo tienen un alto riesgo de disminución de la eficacia de los tratamientos contra el cáncer, el aumento de la metástasis del cáncer y los resultados clínicos pobres [ 4 ]. Por lo tanto, la inhibición de la expresión de HER2 o de su actividad quinasa puede ser un enfoque eficaz para el tratamiento de los cánceres que sobreexpresan HER2. De hecho, un número de HER2 de metas de agentes, incluyendo anticuerpos monoclonales (por ejemplo, trastuzumab) y los inhibidores de la tirosina cinasa de molécula pequeña (por ejemplo, lapatinib), se han desarrollado para el tratamiento de los cánceres con sobreexpresión de HER2-[ 1 ]. Sin embargo, todavía hay una necesidad de nuevas terapias para el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2. Por ejemplo, la medicina china tradicional (TCM) y productos botánicos son actualmente considerados para ser más seguros y pueden ser utilizados como agentes terapéuticos alternativos para el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2 [ 5 , 6 ].

Ganoderma (también conocido como Lingzhi) tiene una larga historia de uso en la medicina popular en los países asiáticos. Ganoderma lucidum (GL) y Ganoderma sinense (GS), que figuran en la farmacopea china (edición de 2010) [ 7 , 8 ], son dos de los las especies más comunes deGanoderma y se han utilizado con fines medicinales en China durante siglos. Las actividades biológicas de GL y GS, particularmente sus propiedades antitumorales y inmunomoduladora, han sido bien documentadas [ 9 ]. Además, Ganoderma tsugae (GT), otra especie muy cultivada deGanoderma , se ha demostrado que tiene muchas propiedades biológicas y farmacológicas, tales como la formación de antiautoantibody [ 10 ], antifibrosis [ 11 ], antiinflamatoria [ 12 ], y las características de antioxidación [ 13 ]. Un número de informes muestran que los GT tiene efectos inhibidores del crecimiento en una variedad de células cancerosas humanas, tales como MDA-MB-231 y las células de cáncer de mama MCF-7 [ 14 ], las células de cáncer colorrectal COLO 205 [ 15], A431 de carcinoma epidermoide las células [ 16 ], células de hepatoma Hep 3B [ 17 ], y células de adenocarcinoma de H23 y H23/0.3 pulmón [ 18 ]. Aunque GT tiene actividad antitumoral en muchas células de cáncer humano, los mecanismos que subyacen a su efecto inhibidor del crecimiento sobre las células cancerosas que sobreexpresan HER2 siguen sin estar claros.

En este estudio, hemos producido una calidad garantizada extracto de GT (GTE) y caracteriza sus efectos antitumorales y los mecanismos moleculares relevantes en las células cancerosas que sobreexpresan HER2 in vitro y in vivo . Nuestros resultados muestran que GTE inhibe el crecimiento celular del cáncer e induce la detención del ciclo celular a través de la modulación de la vía de señalización HER2/PI3K/Akt. También muestran que la combinación de GTE con taxol o cisplatino ralentiza significativamente el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2, lo que indica un uso potencial de GTE en el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2.

2. Materiales y Métodos

2.1. Cultivo Celular

De ovario líneas celulares de carcinoma humano, SKOV-3 (HER2 alta ) y OVCAR-3 (HER2 bajo ), y las líneas de carcinoma de mama, células SKBR-3 (HER2 alta ) y BT-474 (HER2 alta ), se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). El MCF-7/HER2 (HER2 alta ) línea celular de carcinoma de mama humano (MCF-7 de una línea estable HER2-transfectadas) fue proporcionado amablemente por el Dr. MC Hung (Departamento de Oncología Molecular y Celular de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, EE.UU.). El MDA-MB-435/HER2 (HER2 alta ) línea celular de melanoma humano (MDA-MB-435 de una línea estable HER2-transfectadas) fue proporcionado amablemente por el Dr. TD Way (Departamento de Ciencias Biológicas y Tecnología, la Universidad de Medicina China, Taichung, Taiwan). Todas las células se cultivaron en medio DMEM/F12 (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 a 37 ° C.

2.2. Productos Químicos y Anticuerpos

El tiazolil tetrazolio (MTT), cicloheximida (CHX), y N-acetil-L-leucinil-L-leucinil norleucinal (LLnL) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos contra ciclinas D1 y E, p21, p27, fosfo-Akt (Ser308), Akt1 y ubiquitina (Ub) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra fosfo-PI3K, PI3K, fosfo-Erk 1/2, y Erk 1/2 fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología, Inc. (Beverly, MA, EE.UU.).Los anticuerpos contra fosfo-HER2 (Ab-18), HER2 (Ab-3), β -actina, y Ki-67 (Clon MIB-1) fueron adquiridos de Neomarkers Inc. (Fremont, CA, EE.UU.), Calbiochem (San Diego , CA, EE.UU.), Chemicon International Inc. (Temecula, CA, EE.UU.), y Dakocytomation Inc. (Carpinteria, CA, EE.UU.), respectivamente. Taxol (paclitaxel) fue adquirido de Bristol-Myers Squibb (Wallingford, CT, EE.UU.) y cisplatino fue adquirido de Pharmacia & Upjohn SpA (Via Robert Koch 1.2, Milán, Italia).

2.3. Preparación de Ganoderma tsugae Extractos

Ganoderma tsugae (GT) fue proporcionado amablemente por el Luo-Gui-Ying Hongos Agricultura Granja (con el nombre registrado de Tien Shen Lingzhi), Taoyuan, Taiwán. El extracto de GT (GTE) se preparó como se describe anteriormente [ 15 ]. Brevemente, el polvo del cuerpo fructífero GT (5  g) se empapó en 99,9% de metanol (200  ml), se mezcló y se agitó durante 24  h en un agitador giratorio. Después de la centrifugación, el sobrenadante se vertió a través de papel de filtro (Whatman, gato. No. 1001-110), y los residuos se extrajeron con metanol dos veces adicionales como se mencionó anteriormente. Los filtrados se recogen juntos y se someten a la concentración bajo presión reducida (es decir, se evaporó a sequedad bajo presión reducida) para producir un gel de color marrón-como el extracto GT (GTE). El rendimiento fue de aproximadamente el 30%. Después, el GTE se preparó como una solución madre con disolvente metanol (100  mg / ml) y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Para los experimentos con animales, el GTE seco se volvió a disolver en etanol y se diluyó con una solución de suspensión (aceite de 74,5% de maíz, 16% de PEG-400, 4% de Tween-80, 4% Cremophor EL, y 1,5% de etanol, v / v) a una concentración de 10  mg / ml.

2.4. Control de Calidad del GTE través BioResponse Fingerprinting

Se evaluó la calidad de los GTE como se describe anteriormente [ 18 , 19 ]. En pocas palabras, la respuesta biológica genómico a los GTE se determinó en células SKOV-3 tratados con 0,5  mg / ml de GTE. El ARN total se extrajo de las células GTE-tratadas, limpiadas con un kit comercial (kit de extracción de ARN Qiagene, gato.. No 75144), y luego se usa para obtener perfiles de transcripción en estudios de hibridación GeneChip utilizando tecnología de Affymetrix. Los cambios individuales en los niveles de expresión génica obtenidos por los experimentos de GeneChip se midieron por el MAS 5,0 software de Affymetrix. Un método de comparación de patrón de estadística de la plataforma PhytomicsQC, se aplicó Índice de Similitud Phytomics (PSI), para determinar la similitud de lote a lote de los productos botánicos. En general, los lotes clínicamente similares tienen un PSI más de 0,95.

2.5. Ensayo de proliferación celular

La viabilidad celular se determinó usando un ensayo MTT como se ha descrito previamente [ 6 ].Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 6000 células / pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche en un medio que contiene 10% de SFB. Después de que las células adheridas a la placa, se añadieron diversas dosis de GTE a las células, y luego los cultivos se incubaron a 37 ° C durante 72  h. Después de la incubación con el reactivo MTT (0,5  mg / ml) durante 4  h, los números relativos de células viables fueron directamente proporcional a la producción de cristales de formazano solubilizados por DMSO. La solución final se midió utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 545  nm frente a una longitud de onda de referencia de 690  nm.

2.6. De agar blando Ensayo de formación de colonia

El efecto de GTE en el potencial para el crecimiento independiente de anclaje se determinó mediante el ensayo de formación de colonias en agar blando como se describe anteriormente [ 20 ], con ligeras modificaciones. Las células (2 × 10 4  células / pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos que contienen 0,7% de agar de base, agar superior 0,35% y se expusieron a diferentes concentraciones de GTE o un volumen igual de DMEM/F12 dos veces / semana, y se incubaron a 37 ° C durante 3 semanas. Las colonias se tiñeron con el reactivo MTT (5  mg / ml) y luego fotografiados utilizando un microscopio de contraste de fase (100X) equipado con una cámara CCD.

2.7. Análisis de citometría de flujo

Para el análisis del ciclo celular, la distribución de fase se detectó por citometría de flujo como se describe anteriormente [ 6 ]. En resumen, las células se incubaron con GTE o el vehículo durante 24  h y después se fijaron con etanol enfriado con hielo 70% durante la noche a 4 ° C. Antes del análisis, las células se lavaron dos veces con tampón PBS y después se incubaron con yoduro de propidio (PI) solución (50 μ g / ml PI en PBS con 1% de Tween-20 y 10 μ g de RNasa) durante aproximadamente 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. El contenido de ADN se midió mediante citometría de flujo (BD FACS Canto). El software v2.0 FCS expreso se utilizó para analizar los resultados del experimento de citometría de flujo.

2.8. Ensayo de gen informador

Las células se cotransfectaron con pHER2-luc (un promotor impulsado gen de la luciferasa del plásmido constructo HER2) y pCMV- β -gal plásmidos de 6  h y después se incubaron con GTE o el vehículo durante 24  h. El promotor de HER2 y β -galactosidasa ( β -gal) ensayos de actividad de genes se realizaron como se describe anteriormente [ 21 ]. Las unidades relativas de luz de actividad de la luciferasa se ​​normalizaron a β -gal actividad.

2.9. Semicuantitativo reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)

El ARN total fue aislado utilizando solución de Trizol (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). Dos microgramos de RNA total se utilizaron para la primera línea de síntesis de ADNc. Los cebadores apropiados (HER2 sentido: 5′-CAATGGAGACCCGCTGAAC-3 ‘; HER2 antisentido: 5′-CAGTGCGCGTCAGGCTCT-3′; gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) sentido: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘; GAPDH antisentido: 5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘) se utilizaron para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (para 1 ciclo a 94 ° C durante 5 min, 32 ciclos de 94 ° C durante 15  s, 56 ° C durante 30  s, y 72 ° C durante 1  min con una extensión final a 72 ° C durante 5  min). Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% y se detectaron mediante bromuro de (EtBr) de etidio.

2.10. Inmunoprecipitación y Western Blot

Se extrajeron las proteínas de las células mediante la adición de tampón de lisis (20  mM de tampón Hepes pH 7,0, 10  mM de KCl, 2  mM de MgCl 2 , 0,5% NP-40, y los inhibidores de la proteasa).Después de la lisis celular, los extractos se centrifugaron a 16.000  xg durante 10  min a 4 ° C. El contenido de proteína del sobrenadante se midió usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. La inmunoprecipitación se llevó a cabo como se describe anteriormente [ 22 ] con una ligera modificación. En resumen, 300 μ se incubó g de proteína total con anticuerpo anti-HER2 durante la noche a 4 ° C, seguido por proteína A / G PLUS-agarosa (Santa Cruz) durante 3 horas a 4 ° C.Los precipitados se resolvieron mediante electroforesis en dodecil sulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y después se transfirió a un fluoruro de polivinilideno (PVDF). Para la transferencia Western según lo descrito anteriormente [ 22 ], proteínas totales (40 μ g) se cargó al gel y borrado en la membrana PVDF. Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente.Después del bloqueo, las membranas de PVDF se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente, seguido por un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Las señales reactivas se visualizaron utilizando el kit de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL, EE.UU.). Las bandas se escanean y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

2.11. Experimentos con Animales

Los experimentos con animales se realizaron como se describe anteriormente [ 15 ], con ligeras modificaciones. Brevemente, 5 × 10 6 células SKOV-3 se implantaron subcutáneamente en la región del flanco de ratones desnudos BALB / c hembra (BALB/cAnN.Cg- Foxn1 nu / CrlNarl). En total, se utilizaron 19 ratones para este experimento, los ratones portadores de tumor implantados fueron tratados con GTE ( n = 12) o con el vehículo ( n = 7), respectivamente. Los ratones GTE-tratados fueron alimentados con GTE día a una dosis de 200  mg / kg ( n = 5) o 1000  mg / kg ( n= 7) peso corporal; este esquema de dosificación se inició cuando el tumor en desarrollo fue de aproximadamente 50-100  mm 3 en volumen (aproximadamente 2-3 semanas después de que las células cancerosas se implantaron). El volumen del tumor y el peso corporal se controlaron diariamente. Los ratones se sacrificaron para los exámenes de patología cuando el volumen del tumor excedió 1.000  mm 3 . Los tumores fueron extirpados completamente del tejido subcutáneo y se pesaron. Los parámetros bioquímicos y hematológicos fueron utilizados para evaluar el potencial de toxicidad del fármaco.

2.12. La tinción inmunohistoquímica (IHC)

Skov-3 xenotransplantes de tumores y los tejidos circundantes fueron extirpados, se fijaron en formalina, embebido en parafina, se cortaron en 4 – μ m de serie de secciones, y luego se colocan en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos recubiertos con tejido del tumor se eliminó la cera con xileno a continuación, y poco a poco hidratado con alcoholes graduados. Después de la recuperación de antígeno se logró mediante la cocción a presión en 10  mM de tampón de citrato (pH 6,0) durante 6  min, la inmunotinción para Ki-67, HER2, y la ciclina D1 (1   150 dilución) a continuación, se llevó a cabo como se describe anteriormente [ 23 ].

2.13. Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía. Las diferencias entre los grupos de tratamiento fueron analizados por su significado por comparaciones múltiples utilizando análisis de varianza. *P <0,05 y ** P <0,01 frente al grupo de control tratado con vehículo.

3. Resultados

3.1. Control de Calidad del GTE Uso del análisis de huellas dactilares BioResponse

La calidad de la MTC son potencialmente influenciada por muchos factores, como las condiciones de crecimiento y los procedimientos de transformación [ 24 ]. Para evaluar la calidad del GTE, las huellas digitales respuesta biológica fueron analizadas por el método de comparación de modelos de la plataforma PhytomicsQC [ 19 ], que mostró perfiles biológicos altamente concordantes para los GTE (GTE1, GTE2 y GTE3) y extraídos de tres lotes de GT , que actúa sobre las células Skov-3 con un valor de más de 0,95 PSI (Ver Figura complementario S1 A disponible en línea enhttp://dx.doi.org/10.1155/2013/219472 ). Bajo este valor PSI, 376 genes con expresión alterada específicamente (149 upregulations y 227 downregulations) se observaron las huellas dactilares respuesta biológica de GTE (Ver Figura complementario S1 B). Estos resultados sugieren que los productos en polvo GT utilizados en este estudio fueron estables, consistente y de alta calidad.

3.2. GTE Inhibe la proliferación de sobreexpresión de HER2 del cáncer de células

Para determinar si GTE inhibe el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2, que primero se evaluó el impacto de GTE sobre la proliferación celular utilizando el ensayo MTT.Como se muestra en la Figura 1 (a) , el tratamiento de células SKOV-3 (HER2 alta ) con varias concentraciones de GTE (0,1-1  mg / ml) durante 24-72  h resultó en significativa de la dosis y efectos supresores dependientes del tiempo en la proliferación de las células Skov-3, lo que representa una reducción del 0-56% a las 24  h, una reducción del 13-95% a las 48  h, y una reducción del 24-98% en 72  h. Por otra parte, el ensayo de exclusión de azul de tripano también demostró claramente que el GTE exhibió efecto de supresión del crecimiento a dosis de 0,1-0,5  mg / ml, mientras que un efecto citotóxico al menos 1,0  mg / ml en células SKOV-3 ( Figura 1 (b) ).También se observaron efectos antiproliferativos similares de GTE en otras células cancerosas que sobreexpresan HER2, por ejemplo, BT-474 y SKBR-3 (Figuras complementario S2A y S2B).Además, se evaluó la influencia de GTE en el potencial para el crecimiento independiente de anclaje, una característica de las células cancerosas malignas, utilizando el ensayo de formación de colonias en agar blando. Se encontró que el GTE reduce dramáticamente el crecimiento independiente de anclaje de las células SKOV-3 de una manera dependiente de la dosis ( Figura 1 (c) ). Estos resultados sugieren que el GTE es capaz de inhibir la proliferación de las células cancerosas sobreexpresan HER2.

Figura 1

Figura 1
Efecto de GTE sobre la proliferación celular en las células cancerosas que sobreexpresan HER2. (A) Skov-3 células fueron tratadas con 0,5% de metanol (control del vehículo) o varias concentraciones de GTE (0,1, 0,25, 0,5, 0,75, y 1  mg / ml) durante 72  h. La proliferación celular 

Resistencia a los agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, taxol y cisplatino) es un problema importante en el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2 [ 25 , 26 ]. Por lo tanto, examinamos si GTE podría aumentar los efectos inhibidores del crecimiento de medicamentos contra el cáncer en las células SKOV-3, mediante la incubación de las células con ambos agentes contra el cáncer y GTE. Como se muestra en la Figura 1 (d) , GTE mejora de forma significativa los efectos inhibidores del crecimiento de taxol y cisplatino en células SKOV-3. Se encontró que la proliferación de las células SKOV-3 se redujo en un 30%, 45%, y 37% en las células expuestas al GTE (0,25  mg / ml), el taxol (10  ng / ml), y cisplatino (10 μ g / ml ) solo, respectivamente. Sin embargo, la proliferación de las células SKOV-3 se redujo en un 73% y 77% en las células expuestas a GTE combinados con taxol y cisplatino, respectivamente. Del mismo modo, también encontramos que GTE podría aumentar la eficacia quimioterapéutica de medicamentos contra el cáncer contra otras líneas celulares de cáncer que sobreexpresan HER2, por ejemplo, MDA-MB-453/HER2 (Figuras complementario S3A y S3B). Estos hallazgos sugieren que puede GTE chemosensitize las células cancerosas que sobreexpresan HER2 a los fármacos contra el cáncer (por ejemplo, taxol y cisplatino).

3.3. GTE G1 induce la fase de la detención por la modulación de la expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular

Como se mencionó anteriormente, se observó una influencia inhibidora del crecimiento de GTE en células SKOV-3 (Figuras 1 (a) – 1 (c) ). Para determinar si la propiedad antiproliferativa de GTE era debido a la interrupción del ciclo celular, se utilizó citometría de flujo para analizar el cambio de ciclo celular en las células SKOV-3. Como se ilustra en la Figura 2 (a) , el tratamiento de células SKOV-3 con GTE dado lugar a un aumento distinta (aproximadamente 24%) en el número de células en la fase G1 a una concentración de 0,5  mg / ml GTE. Este aumento en el número de células en la fase G1 fue acompañado por una disminución concordante en el número de células en las fases S y G2 / M. Se observaron patrones de distribución del ciclo celular GTE mediadas similares en el BT-474 (HER2 alta células) (Figura S4A). Estos hallazgos sugieren que GTE inhibe el crecimiento de las células cancerosas sobreexpresan HER2 mediante la modulación de la progresión del ciclo celular.

La figura 2

La figura 2
Efecto de GTE sobre la distribución del ciclo celular en las células cancerosas que sobreexpresan HER2. (A) Skov-3 células fueron tratadas con el control de vehículo (metanol al 0,5%) o diversas concentraciones de GTE (0, 0,25, y 0,5  mg / ml) durante 24  h. La distribución del ciclo celular 

Diferentes reguladores del ciclo celular, tales como ciclinas, quinasas dependientes de ciclina (CDKs), y los inhibidores de CDK (CKI), están involucrados en múltiples vías celulares que regulan fuertemente la progresión del ciclo celular [ 27 ]. Para dilucidar los mecanismos moleculares de la detención del ciclo celular inducida por el GTE, se evaluó el impacto de los GTE en la expresión de los reguladores del ciclo celular. Hemos demostrado que, después del tratamiento GTE, los niveles de proteína de las ciclinas D1 y E fueron regulados a la baja, mientras que los niveles de proteína de p21 y p27 se upregulated en células SKOV-3 (Figuras 2 (b) y 2 (c) ). Del mismo modo, GTE también afectó drásticamente la expresión de reguladores del ciclo celular (por ejemplo, ciclinas D1 y E) en dos HER2-overexpressing líneas celulares de cáncer de más, es decir, BT-474 (Figura S4 B) y 3-SKBR células (datos no presentados ). Estos resultados sugieren que GTE inhibe el crecimiento celular mediante la regulación de la expresión de reguladores del ciclo celular en las células cancerosas que sobreexpresan HER2.

3.4. GTE Inhibe HER2/PI3K/Akt cascadas de señalización

Sobre la base de los resultados mencionados anteriormente, se produjo un efecto inhibidor del crecimiento significativo de GTE en las células cancerosas que sobreexpresan HER2 ( Figura 1 ). A continuación exploramos si la inhibición de la proliferación fue causado por la regulación de la expresión de la proteína HER2. Como se muestra en las figuras 3 (a) y 3 (b) , el tratamiento de células SKOV-3 con GTE resultado en una dosis-y marcada disminución dependiente del tiempo en los niveles de proteína HER2. Del mismo modo, GTE también disminuyó la expresión de la proteína de HER2 en otros HER2 altas líneas celulares, tales como SKBR-3, BT-474, y MCF-7/HER2 ( Figura 3 (d) , que complementa la figura S5) y un HER2 bajo línea celular , OVCAR-3 (Figura S5 B).

Figura 3

Figura 3
Efecto del GTE en HER2/PI3K/Akt y Ras / MAPK cascadas de señalización en las células cancerosas que sobreexpresan HER2.(A) Skov-3 células fueron tratadas con varias concentraciones de GTE (0, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, y 1  mg / ml) durante 24  h. La expresión de HER2 

La vía de señalización de HER2 se sabe están asociados con la proliferación celular, por lo tanto, se probó el impacto de los GTE de dos vías principales de aguas abajo de HER2: la PI3K/Akt y Ras / MAPK cascadas de señalización [ 1 ]. Como se muestra en la Figura 3 (c) , GTE exhibió efectos inhibidores sobre la fosfo-HER2, fosfo-PI3K, y fosfo-Akt sin una reducción notable en fosfo-Erk 1/2 en las células SKOV-3. Por otra parte, GTE mostró efectos similares sobre la fosfo-HER2 y fosfo-Akt en otras líneas celulares que sobreexpresan HER2, por ejemplo, SKBR-3 y BT-474 ( Figura 3 d)). Estos datos indican claramente que GTE ejerce efectos inhibitorios sobre las cascadas HER2/PI3K/Akt de señalización en las células cancerosas con sobreexpresión de HER2.

3.5. GTE regula a la baja expresión de la proteína HER2 mediante la modulación de la expresión génica y la estabilidad de la proteína del HER2

Como se mencionó anteriormente, nuestros resultados mostraron una influencia inhibidora dramática de GTE en la expresión de la proteína HER2 en las células cancerosas que sobreexpresan HER2 ( Figura 3 ). Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes de la regulación a la baja GTE-mediada de HER2, probamos el efecto de GTE en la actividad transcripcional de HER2gen. La expresión de ARNm de HER2 se redujo claramente en SKOV-3 ( Figura 4 (a) ) y BT-474 células (Figura S6A) expuesto a 0,25 y 0,5  mg / ml de GTE de 24  h, tal como se determina por RT-PCR. Además, el ensayo de gen reportero indicó que GTE disminuyó la actividad del promotor de HER2 en una manera dependiente de la dosis en las células SKOV-3 ( Figura 4 (b) ). Consistente con la disminución de expresión de la proteína HER2, tanto en el nivel de ARNm y la actividad del promotor de HER2 se downregulated por GTE. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que GTE agota los niveles de proteína de HER2 través de la modulación de la HER2 actividad de los genes.

Figura 4

Figura 4
Efecto de GTE en la expresión génica y la estabilidad de la proteína de HER2. (A) Skov-3 células fueron tratadas con GTE (0,25 o 0,5  mg / ml) o el vehículo durante 24  h. El nivel de ARNm de HER2 se midió mediante RT-PCR semicuantitativa como se describe en la Sección 

Debido a una disminución general de la estabilidad de proteínas también podría ser responsable de la reducción de los niveles de la proteína HER2, hemos examinado el efecto del GTE de estabilidad de la proteína HER2 y encontramos que la vida media de HER2 se acorta claramente por el tratamiento GTE en SKOV-3 ( Figura 4 (c) ) y BT-474 células (Figura S6B). En general, las proteínas tales como HER2 etiquetados con poliubiquitina y luego degradado por el sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS). Hemos probado si la estabilidad de la proteína HER2 GTE mediada era debido a la activación de los UPS. Como se muestra en la Figura 4 (d) , la cantidad de polyubiquitinated HER2 (HER2-Ub (n) ) de proteínas fue significativamente mayor en las células SKOV-3 expuestos a 0,5  mg / ml para el GTE 24 o 48  h. Además, el tratamiento de células SKOV-3 con LLnL, un inhibidor del proteasoma, evita eficazmente la degradación del GTE-mediada de la proteína HER2 ( Figura 4 (e) ). Estas observaciones sugieren que también puede producirse la reducción de HER2 por GTE a través de la inducción de la proteína HER2 inestabilidad / degradación.

3.6. GTE inhibe el crecimiento de SKOV-3 tumores transplantados por proteína HER2 modulante

Para determinar el potencial para los efectos contra el cáncer de GTE in vivo , hemos utilizado xenoinjertados ratones desnudos portadores de tumores. Después de que el volumen de los tumores SKOV-3 xenoinjertados alcanzó aproximadamente 50-100  mm 3 , los ratones fueron oralmente (po) administrada ya sea GTE (200 y 1000  mg / kg / día) o vehículo durante 31 días. Como se ilustra en la Figura 5 (a) , los ratones desnudos tratados con 200 o 1000  mg / kg / día de GTE exhibido una marcada inhibición en el crecimiento de tumores SKOV-3-implantados en relación con la del grupo de control. No hubo ninguna alteración significativa en los pesos corporales de los ratones desnudos con o sin tratamiento GTE, lo que indica GTE no tenía toxicidad aparente ( Figura 5 (b) ). Además, en comparación con los controles del vehículo, la expresión de la proteína Ki-67, un marcador de proliferación, se redujo significativamente en los tumores GTE-tratados ( Figura 5 (c) ), lo que indica que GTE inhibe la proliferación de células de Skov-3 tumores xenoinjertados in vivo .

La figura 5

La figura 5
Efecto de GTE sobre el crecimiento de tumores SKOV-3 xenografted in vivo . (A) la tasa de crecimiento del tumor fue significativamente más lenta en el grupo GTE-tratado (200  mg / kg / día, n = 5; o 1,000  mg / kg / día, n = 7) frente al grupo control ( n = 7). Los volúmenes de los tumores 

En nuestra in vitro en los estudios, se demostró que GTE inhibió la proliferación de células inducida por G1 y la detención del ciclo celular en las células cancerosas que sobreexpresan HER2 a través de la modulación de la expresión de HER2. Para determinar los mecanismos moleculares subyacentes del efecto anticanceroso GTE mediada observado en los tumores SKOV-3 xenoinjertados, secciones de tumor se inmunotiñeron para la proteína HER2 y ciclina D1, ciclina el primero que se activa durante la progresión de la fase G1 / S. En comparación con el grupo control, las intensidades de tinción de HER2 y ciclina D1 fueron dramáticamente regulados a la baja en las células tumorales GTE-tratados (200  mg / kg / día) ( Figura 5 (c) ). En conjunto, estos datos sugieren que el GTE inhibió la proliferación de células tumorales mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la modulación de la vía de HER2 in vitro y in vivo .

4. Discusión

HER2 sobreexpresión se asocia con un alto riesgo de metástasis del cáncer y una mala respuesta a las terapias antitumorales [ 4 ]. El tratamiento con agentes terapéuticos que se dirigen específicamente a las células cancerosas con sobreexpresión de HER2, como lapatinib y trastuzumab, ha mejorado los resultados clínicos. Además de los agentes contra el cáncer, se ha demostrado que una serie de medidas técnicas de conservación y productos botánicos para ser agentes adyuvantes eficaces y útiles para el tratamiento de cáncer con sobreexpresión de HER2 [ 5, 6 , 26 ]. Ganoderma tsugae (GT), uno de los más especies comunes de Ganoderma cultivadas en Taiwán, se ha demostrado que tiene efectos antiproliferativos sobre las células cancerosas humanas [ 15 , 16 , 18 ]. En este estudio, se presenta por primera vez que el extracto de GT (GTE) tiene un efecto inhibidor del crecimiento distinta sobre las células cancerosas que sobreexpresan HER2 in vitro (Figuras 1 (a) – 1 (c) ) y in vivo ( Figura 5 (a) ).

La perturbación de la progresión del ciclo celular en células de cáncer es una estrategia útil para detener el crecimiento del cáncer [ 28 ]. Además, la detención del ciclo celular también proporciona una ocasión para que las células que someterse a reparar o muerte celular programada. Un número de medidas técnicas de conservación (por ejemplo, GT) exhiben marcados efectos inhibidores del crecimiento sobre las células cancerosas a través de la interrupción de la progresión del ciclo celular. En informes anteriores demuestran que GT inhibe la proliferación celular mediante la inducción de la detención del ciclo celular en la fase G2 / M en Hep3B hepatoma y COLO205 células de cáncer colorrectal [ 15 , 17 ] y en la fase S en H23/0.3 células de adenocarcinoma de pulmón [ 18 ]. En este estudio, nuestros in vitro resultados indican que el tratamiento induce la detención del GTE fase G1 a través de la modulación de los reguladores del ciclo celular (por ejemplo, ciclinas D1 y E, p21, y p27) con sobreexpresión de HER2 en células SKOV-3 de cáncer de ovario y cáncer de mama BT-474 las células ( Figura 2 y la Figura complementario S4). Los diferentes efectos de GTE sobre el ciclo celular pueden ser debido a especificidad de tipo celular y / o como resultado de la modulación de la transducción de señales y diferentes moléculas reguladoras del ciclo celular.

Dos principales enfoques terapéuticos para el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2 implican agentes que reducen la expresión y la activación / fosforilación del receptor HER2 [ 29 ].En este estudio, hemos demostrado que el GTE regula a la baja tanto en el nivel de HER2 y su forma fosforilada en SKOV-3, BT-474, y 3 SKBR células ( Figura 3 ). Se conjeturó que el efecto inhibidor de GTE en los niveles de fosfo-HER2 puede ser debido a la inhibición de la expresión de HER2. De acuerdo con esta hipótesis, se observó una disminución significativa en la expresión de ARNm de HER2 ( Figura 4 (a) ) y la actividad de su promotor ( Figura 4 (b) ) después del tratamiento con GTE. Además, hemos establecido una serie de HER2 promotor supresión construcciones (F1: -1067 ~ -103, F2: -871 ~ -103, F3: -495 ~ -103 y F4: -207 ~ -103) y encontró que GTE interacciona con el promotor de HER2 en el -871 ~ -495 región (datos no publicados).Sobre la base de las predicciones de software Genomatix, hay varios supuestos sitios de unión del factor de transcripción localizados en esta área, como el factor de células T (FCT), forkhead caja K2 (FOXK2) y la proteína de unión a GATA 2 (GATA2). Por lo tanto, se necesitan más estudios para aclarar la base molecular por el cual la transcripción de la HER2 gen está regulada para ayudar en última instancia, en el desarrollo de mejores estrategias para el tratamiento de los cánceres con sobreexpresión de HER2.

También se investigó la regulación de la estabilidad de la proteína HER2 / degradación como otra posible explicación de cómo GTE controla expresión de la proteína HER2. Se encontró que la vida media de la proteína HER2 se reduce notablemente por GTE en SKOV-3 ( Figura 4 (c) ) y células BT-474 (Figura S6B). Esta observación nos ha llevado a la hipótesis de que la disminución de la estabilidad de la proteína HER2 puede ser debido a la inducción de polyubiquitination de HER2 por GTE ( Figura 4 (d) ), que conduce a su degradación por el complejo proteasoma. Se utilizó LLnL, un inhibidor de la proteasoma, para confirmar que el efecto de GTE en la degradación de la proteína HER2 implica la activación del sistema de la ubiquitina-proteasoma ( Figura 4 (e) ). Por otra parte, se informó de varias moléculas, tales como la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), casitas de linfoma de linaje B (c-Cbl), y la peptidil-prolil cis / trans isomerasa 1 (PIN1), que se requiere para el mantenimiento de la estabilidad y la activación de HER2 [ 30 – 32 ]. Sería conveniente para determinar si estas moléculas están implicadas en la degradación inducida por el GTE / inestabilidad de la proteína HER2.

Por lo general, el cáncer de las células que sobreexpresan HER2 responde mal a los agentes quimioterápicos. Supresión de la vía de HER2 por HER2-dirigidas a la terapéutica potencia la actividad contra el cáncer de los agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de cánceres que sobreexpresan HER2 [ 25 , 33 ]. Un número de informes muestran que el uso combinado de algunos extractos de medidas técnicas de conservación (por ejemplo, rizoma Coptis y Glycyrrhizae radix) con agentes antitumorales como resultado la inhibición sinérgica del crecimiento en células de cáncer [ 34 , 35 ]. También se ha informado de que la combinación de agentes contra el cáncer con GTE ralentiza la tasa de crecimiento de las células del cáncer [ 15 , 18 ]. En este documento, se demuestra por primera vez que el uso combinado de GTE con taxol ( Figura 1 (d) ), cisplatino (Figura S3), o doxorubicina (datos no mostrados) en los resultados de la inhibición del crecimiento sinérgico de las células cancerosas sobreexpresan HER2. Estos resultados indican que GTE puede ser un agente terapéutico prometedor adyuvante en el tratamiento de los cánceres con sobreexpresión de HER2.

En conclusión, se proporciona una presentación esquemática de los posibles mecanismos moleculares in vitro y in vivo de los efectos inhibidores de GTE sobre la proliferación de las células cancerosas que sobreexpresan HER2 ( Figura 6 ). Nuestros resultados indican que GTE G1 induce la detención del ciclo celular a través de la regulación de la vía de señalización HER2/PI3K/Akt, lo que conduce a una reducción en el crecimiento de las células cancerosas que sobreexpresan HER2.Nuestros datos también demuestran que el agotamiento de la proteína HER2 por GTE implica una inhibición de la actividad transcripcional de la HER2 gen y un aumento en la degradación del proteasoma dependiente de la proteína HER2. Además, también hemos demostrado que una combinación de GTE con medicamentos contra el cáncer (por ejemplo, taxol, cisplatino, doxorrubicina y) ejerce efecto sinérgico inhibidor del crecimiento sobre las células cancerosas que sobreexpresan HER2. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que GTE puede ser un agente terapéutico adyuvante útil y eficaz para el tratamiento de los cánceres que expresan altamente HER2.

La figura 6

La figura 6
Un modelo esquemático del efecto antiproliferativo GTE-mediada en las células cancerosas que sobreexpresan HER2.Estimulación ligando induce la activación del receptor HER2, que a su vez activa la vía de señalización PI3K/Akt y luego promueve el crecimiento celular y 
Material complementario

Con el fin de presentar nuevas evidencias para este estudio, se realizaron los siguientes experimentos y los resultados se demostraron como material de supplementay de relacionarse con los resultados correspondientes se muestran en el texto principal. El material suplementario incluye:

(1). Control de calidad de Ganoderma tsugae extractos (GTE) se puso a prueba mediante la técnica de fingerprinting respuesta biológica (Ref. 18 y 19) (Fig. S1).

(2). GTE también afectó a la proliferación de sobreexpresión de HER2 del cáncer de pecho BT474 y SKBR-3 células (Fig. S2) (en relación con la Figura 1a).

(3). GTE también sensibilizados los efectos anticancerígenos de taxol y cisplatino en el cáncer de mama con sobreexpresión de HER2 MDA-MB-435/HER2 células (Fig. S3) (en relación a la figura 1d).

(4). GTE también afecta a la distribución del ciclo celular de las células que sobreexpresan HER2 del cáncer de pecho BT474 (Fig. S4) (en relación con la Figura 2).

(5). GTE también afectó a la expresión de la proteína HER2 en el cáncer de mama MCF-7/HER2 (HER2 alta ) y OVCAR-3 (HER2 bajo ) células (Fig. S5) (en relación a las figuras 3 (a, b).

(6). GTE también afectó a la expresión de ARNm de HER2 y la estabilidad de la proteína HER2 en las células de cáncer de mama BT-474 (Fig. S6) (en relación a las figuras 3 (c, d).

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Contribución de los autores

C.-C. Ou y J.-W. Li contribuyeron igualmente a este estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia (NSC100-2313-B-039-005-MY3) y en parte de la Universidad de Medicina China (CMU) (CMU95-296), Taiwan. Los autores también desean agradecer a los miembros de la Investigación Médica Core banquetes Centro (Oficina de Investigación y Desarrollo, CMU, Taichung, Taiwan) por su excelente apoyo técnico.

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